2-甲基戊烷，由于其具有“可移除"的特性，成為近幾年炙手可熱的高壓冷凍保護(hù)劑。越來越多的研究者，將其應(yīng)用于各種類型的生物樣品中高壓冷凍實(shí)驗(yàn)中。但是，由于其特殊的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)成功率一直不高。本文將從2-甲基戊烷物化性質(zhì)入手，逐步深入解析其作為高壓冷凍保護(hù)劑的優(yōu)勢(shì)，及其與其他常用冷凍保護(hù)劑的差別，最后介紹兩種2-甲基戊烷“移除"方法，并指出了導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的可能原因。
Part 1：2-甲基戊烷物化性質(zhì)
2-甲基戊烷鏈狀烷烴，極性低，不溶于水。2-甲基戊烷沸點(diǎn)低，閃點(diǎn)低（表1），意味著它在室溫下極易揮發(fā)并產(chǎn)生可燃蒸汽，與空氣混合可形成爆炸性混合物，遇到明火、高熱或火花極易引發(fā)燃燒爆炸。同時(shí)，其揮發(fā)的蒸汽對(duì)眼睛、皮膚和呼吸道有刺激性，接觸后會(huì)產(chǎn)生灼燒感。
因此，在使用2-甲基戊烷的時(shí)候，需要注意通風(fēng)，預(yù)防明火，并佩戴護(hù)具，做好個(gè)人防護(hù)。
表1. 2-甲基戊烷物理化學(xué)性質(zhì)
Part 2：2-甲基戊烷作為高壓冷凍保護(hù)劑的優(yōu)勢(shì)
可去除性
這是2-甲基戊烷的特性，其可以通過低溫洗滌或者升華去除，解決了傳統(tǒng)高壓冷凍保護(hù)劑無法去除的痛點(diǎn)。
易形成玻璃態(tài)：
2-甲基戊烷在降溫時(shí)，將直接轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，而不形成晶體，此特性對(duì)保護(hù)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要
高導(dǎo)熱性
2-甲基戊烷在高壓環(huán)境下，能夠高效地傳導(dǎo)熱量，確保樣品被瞬間、均勻地冷凍。
Part 3：2-甲基戊烷 vs 十六碳烯&BSA
如表2所示，2-甲基戊烷與十六碳烯類似，均為有機(jī)烴類物質(zhì)，具有相似的熱導(dǎo)率和低溫相態(tài)，并且其對(duì)樣品的保護(hù)機(jī)制均是替代樣品外層多余水分，抑制外層冰晶生長(zhǎng)。兩者最主要的區(qū)別在于去除性，2-甲基戊烷能夠通過低溫升華或洗滌去除，比較適合全冷凍制樣路線；而十六碳烯則需要有機(jī)溶劑溶解，比較適合冷凍-常溫的冷凍替代路線。
與上述兩者不同，牛血清蛋白（BSA）主要以水溶液形式存在，其主要是通過與生物大分子結(jié)合、維持水化層等方式，減少低溫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性/聚集，本質(zhì)上是一個(gè)穩(wěn)定劑而非導(dǎo)熱介質(zhì)。并且，由于其含有大量水，容易產(chǎn)生冰晶，反而會(huì)破壞樣品結(jié)構(gòu)，另外BSA與水共存，不具備可去除性。
注意誤區(qū)！！！ 熱導(dǎo)率 ≠ 導(dǎo)熱性能
看了上一段的讀者可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)疑問，冰的熱導(dǎo)率為2.2W/m*k（-20°C），遠(yuǎn)高于2-甲基戊烷和十六碳烯，但為什么還說BSA不算導(dǎo)熱介質(zhì)呢？
這里需要澄清一個(gè)概念：熱導(dǎo)率 ≠ 導(dǎo)熱性能。
對(duì)于高壓冷凍而言，我們看重的導(dǎo)熱性能，不僅僅指的是冷凍保護(hù)劑在理想狀態(tài)下的熱導(dǎo)率，更取決于其冷凍過程中實(shí)際的物理狀態(tài)。
換句話說就是，盡管固體冰具有很高的熱導(dǎo)率，但是一旦形成了冰，就失去了高壓冷凍制樣的意義了。
因此，對(duì)于高壓冷凍而言，冷凍保護(hù)劑有效的熱導(dǎo)性能 = 熱導(dǎo)率 * 形成均一玻璃態(tài)的能力。
表2. 2-甲基戊烷、十六碳烯和BSA性能對(duì)比表
Part 4：2-甲基戊烷的去除方法
如表3所示，2-甲基戊烷的去除方法主要有低溫洗滌和原位升華。
其中，低溫洗滌主要利用2-甲基戊烷的溶解性，在低溫下進(jìn)行溶劑置換，進(jìn)行保護(hù)劑去除。上述方法需要有一個(gè)可控溫度的環(huán)境，需要嚴(yán)格把控洗滌時(shí)間，否則容易造成樣品表面損傷。并且，低溫洗滌容易殘留微量的有機(jī)溶劑。
原位升華方法，則是利用了2-甲基戊烷的揮發(fā)性，在高真空條件下，精準(zhǔn)控制樣品溫度，升華保護(hù)劑。整個(gè)過程需要對(duì)樣品溫度有精準(zhǔn)把控，溫度不能太高，否則容易造成2-甲基戊烷不可控形態(tài)變化，甚至樣品玻璃態(tài)冰轉(zhuǎn)化為晶體冰。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，能夠無殘留地去除保護(hù)劑。
表3. 2-甲基戊烷低溫洗滌或原位升華去除方法
Part 5：2-甲基戊烷實(shí)驗(yàn)失敗的可能原因
物理因素：熱應(yīng)力與相變
1
熱膨脹系數(shù)差異：2-甲基戊烷與載網(wǎng)金屬材質(zhì)熱膨脹系數(shù)差異巨大，在低溫洗滌過程中，不同材質(zhì)收縮程度不同，產(chǎn)生強(qiáng)烈、不均勻的熱應(yīng)力，破壞樣品固定力，將樣品從載網(wǎng)上“擠下來"。
2
相變風(fēng)險(xiǎn)：洗滌過程若發(fā)生微小的溫度波動(dòng)，可能破壞樣品玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致冰晶重排或再結(jié)晶，將樣品從載網(wǎng)上“推下來"。
機(jī)械因素，流體沖刷
1
物理沖刷：液態(tài)乙烷/丙烷洗滌2-甲基戊烷過程中，會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生直接物理沖擊，足以把吸附力較弱的樣品，從載網(wǎng)上“沖下來"。
2
升華應(yīng)力：升華過程中，若溫度控制不當(dāng)，則容易導(dǎo)致2-甲基戊烷快速升華，并帶走周圍熱量，產(chǎn)生拉伸力，將樣品從載網(wǎng)上“拉下來"。
物理化學(xué)因素：界面作用力破壞
1
黏附機(jī)制：樣品和載網(wǎng)黏附方式，往往取決于兩者之間的范德華力或者靜電力。有機(jī)溶劑洗滌過程，可能會(huì)直接削弱或破壞這些粘附力，使樣品從載網(wǎng)上“落下來"。
2
微觀生物機(jī)制：某些生物樣品，能夠通過表面特殊結(jié)構(gòu)，如菌毛等，將其錨定在載網(wǎng)上。2-甲基戊烷作為一種有機(jī)溶劑，可能會(huì)將這些錨點(diǎn)溶解或破壞，使樣品從載網(wǎng)上“掉下來"。
如同所有的高壓冷凍保護(hù)劑，2-甲基戊烷的可去除性既是其獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，又是造成實(shí)驗(yàn)失敗的最主要原因。只有深入了解其作用機(jī)制，精準(zhǔn)控制每一步參數(shù)，才能步步為營(yíng)，獲得真實(shí)的樣品信息。
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