大組織樣品原位冷凍電鏡斷層成像樣品制備流程｜北大團隊打通組織cryo-ET瓶頸，實現胰島β細胞原位分子觀測

冷凍電鏡斷層成像（cryo-ET）能在細胞原生環境解析三維分子結構，但大組織、多細胞樣本前處理長期是行業難點。2023年北京大學郭強團隊在Journal of Structural Biology提出了一套全商用設備適配的高效組織cryo-FIB制樣流程；以小鼠胰島為模型，測出胞內原生胰島素晶體晶格參數，實現組織原位高分辨結構解析，為厚組織樣本原位分子電鏡研究提供標準化方案。

一、組織cryo-ET難在哪？

1、cryo-ET核心優勢與天然局限

單顆粒冷凍電鏡需要純化蛋白，會破壞細胞內天然分子互作；cryo-ET無需分離組分，可直接解析細胞三維原位分子架構。

但受限于電子束的穿透能力，冷凍透射電鏡（cryo-TEM）要求樣品厚度控制300 nm以內，但絕大多數完整細胞和組織切片而言，必須通過冷凍聚焦離子束（cryo-FIB）或冷凍超薄切片機（Leica EM FC7/UC Enuity）減薄，制備出電子透明薄片（lamella）。

2、當前組織制樣的三大痛點

1.高壓冷凍保護/填充劑干擾

傳統高壓冷凍用十六烯作為冷凍填充劑，樣品被厚保護層包裹，難以定位目標組織區域；改用2-甲基戊烷的方案需真空升華30分鐘，且殘留培養液會顯著降低制樣成功率。

2.傳統提取工藝耗時且門檻高

傳統的商用夾持式機械手提取單塊薄片效率低下、通量受限，且高度依賴定制原型設備，難以在普通實驗室普及。

3.組織與單細胞體系差異巨大

懸浮細胞和細胞系的FIB減薄流程無法直接適配多層致密組織；目前，行業內仍缺乏一套模塊化、標準化且具備高度可落地性的完整制樣流水線。

總體而言，現有的組織制樣方法多停留在理論方案階段，缺乏經過完整優化和實測驗證的標準化流水線。建立一套高效、穩定、可落地的完整工作流，正是本研究的核心突破口。

二、全新大組織樣品制備工作流

大組織樣品制備工作流全流程均基于成熟的商用設備搭建無需依賴定制儀器，從而顯著降低了技術門檻并提升了方法的可重復性。該流程有效兼顧了制備效率與成功率，單塊薄片平均耗時僅為3小時，提取成功率高達90%。該工作流主要包含以下三大核心步驟：

步驟1：組織目標區域精準分離（兩種可選方案，圖1a）

精準分離胰島組織（二選一）

酶解法：膠原酶消化胰腺，批量獲取 80–200μm 胰島團；

激光顯微切割：切片后精準截取 100×100μm 目標區域，適配復雜異質性組織。

步驟2：改良無包埋高壓冷凍（HPF），2 分鐘快速去除冷凍填充劑  （圖1b）

傳統方案痛點：冷凍填充劑包裹組織，遮擋目標區域、后續修塊步驟繁瑣。

本工作改良方案：

1.以2-甲基戊烷作為冷凍填充劑，將組織直接鋪于電鏡載網（EM grid）完成高壓冷凍；

2.冷凍后將樣品夾具浸入-170℃乙烷-丙烷混合液，僅需2 min即可溶解去除2-甲基戊烷，無需長時間真空升華；

3.殘留培養液/培養基可充當天然保護劑，對操作容錯率更高。

不足：2-甲基戊烷可輕微穿透細胞膜，樣品最表層細胞會出現輕微結構損傷，但組織內部細胞超微結構完整，不影響核心觀測。

步驟3：冷凍FIB提取（lift-out）超薄薄片制備，自研鉬半載網大幅提升穩定性（ 圖1c）

全文創新核心，摒棄傳統夾持機械手，采用低溫探針+再沉積粘接法，同時，搭配實驗室自研鉬材質半載網，不僅制定了完整的標準化操作規范，更大幅提升了薄片（lamella）在提取過程中的機械穩定性。

圖1：多細胞冷凍電子斷層掃描樣品制備流程示意圖

三、工作流實測結果：小鼠胰島原位分子級成像，多項發現

采用此方法，研究者對小鼠胰島進行冷凍電鏡原位結構觀察，實現了β細胞胰島素晶體的原位分析（圖2）。研究者觀察到三種不同類型的囊泡，分別為棒狀晶體囊泡(圖 2h)，未成熟胰島素晶體囊泡(圖 2i)以及成熟的胰島素晶體囊泡(圖2j)，并對囊泡的數量與位置分布進行了統計(圖2a，2k)。分析結果表明成熟的胰島素晶體囊泡占97%，且不同類型的胰島素囊泡分布無明顯特征。而此前使用單細胞體系研究發現不同成熟狀態的胰島素囊泡呈現有組織的空間分布，說明了組織等多細胞原位結構研究的必要性

圖2：胰島β細胞的原位結構

通過對此流程所收集的數據進行深入分析(圖3)，確定了胰島素的晶胞參數（圖 3c-f）。其與體外觀察到的六方晶體的結構差異則表明細胞內生理條件對晶體堆積的潛在影響。

圖3：胰島素晶體原位晶胞參數測定（a）胰島β細胞內代表性斷層掃描圖像的橫截面。（b）圖(a)中所示的斷層掃描圖像的3D渲染。前位遷移核糖體（青色）和后位遷移的核糖體（黃色）、胰島素囊泡（藍色）、內質網（ER）（橙色）和線粒體（深綠色），通過斷層掃描平均計算確定了核糖體。核糖體在原始位置和取向上進行了映射，通過亞斷層掃描平均計算確定核糖體的位置和取向。（c,e）胰島素晶體晶格結構。(g)從9個斷層圖像中獲得的3795個核糖體在分類和優化后形成了兩種不同的構象：前移態（青色）和后移態（黃色）。(h)兩種構象首先與大亞基對齊，僅小亞基以表面模型形式顯示。星號標示了明顯的棘輪結構。(i) 兩種核糖體結構的傅里葉殼相關曲線在使用0.143作為截止值時，顯示出16 ?的分辨率。

四、總結

組織樣品前處理是限制cryo-ET走向生物醫學常規研究的核心瓶頸。北京大學郭強團隊搭建的模塊化多細胞組織cryo-ET制樣工作流，通過改良無包埋高壓冷凍、優化低溫探針提取工藝及配套剛性鉬半載網，在商用設備體系下實現高效、穩定、大視野的組織超薄薄片制備。

研究以胰島β細胞為范例，不僅直觀證明組織原位觀測相比細胞系的獨特生物學信息，更解析原生環境胰島素晶體結構，為糖尿病相關分泌機制、各類器官組織原位分子結構研究提供了一套可直接重復的標準化實驗方案，大幅降低了組織冷凍電鏡斷層成像的實驗門檻。

通訊作者介紹：

郭強，現任北京大學生命科學學院研究員，北大-清華生命科學聯合中心研究員。他專注于原位結構生物學研究，其團隊以冷凍光電聯用（CLEM）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）為核心技術，致力于在近生理條件下對亞細胞結構進行高分辨率三維成像，旨在從“細胞建筑學"（亞細胞結構如何構建功能細胞）和“生物大分子社會學"（大分子與細胞器間的相互關系）兩個層面，揭示生命活動的基本規律。他曾獲多項重要榮譽，包括2024年北京市杰出青年科學基金、2021年拜耳學者和博雅青年學者等。

文章使用Leica EM ICE多功能高壓冷凍儀可實現200μm厚組織無冰晶玻璃化固定，兼容各類電鏡載網，適配大組織樣品原位冷凍電鏡斷層成像整套實驗流程。

Leica EM ICE高壓冷凍儀

參考文獻：

1.Yichun Wu. Changdong Qin. Wenjing Du. Zhenxi Guo. Liangyi Chen. Qiang Guo. (2023). A practical multicellular sample preparation pipeline broadens the application of in situ cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology .215(3): 107971.