島津原子力顯微鏡在生物學(xué)及生命科學(xué)中的應(yīng)用

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在生物學(xué)及生命科學(xué)研究中，各種顯微鏡是不可少的工具。列文虎克發(fā)明的簡(jiǎn)單顯微鏡推開了人類對(duì)微生物觀察的大門，顯微學(xué)的發(fā)展隨著顯微工具的進(jìn)步而深入。光學(xué)顯微鏡利用激光共聚焦技術(shù)將分辨率逼近了可見光波長(zhǎng)的一半，電子顯微鏡進(jìn)一步將其提高到納米級(jí)別。但是對(duì)于生物學(xué)和生命科學(xué)而言，二者都無(wú)法完全滿足應(yīng)用需求。對(duì)于細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)和生物大分子，光學(xué)顯微鏡的分辨率不足；而電子顯微鏡雖然有效提高了觀察能力，但嚴(yán)格要求真空環(huán)境，無(wú)法在細(xì)胞及生物大分子的活性狀態(tài)（液體環(huán)境）中使用。

原子力顯微鏡的問(wèn)世，成功解決了在高分辨率與液體環(huán)境觀測(cè)之間難以兼得的難題。作為一種三維形貌觀察工具，原子力顯微鏡不僅具備超高分辨率，而且支持在液體環(huán)境下工作，是一種理想的生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)觀測(cè)設(shè)備。除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以對(duì)多種表面屬性進(jìn)行定量觀測(cè)。例如，基于力學(xué)測(cè)試的表面機(jī)械性能測(cè)試。這些性能為原子力顯微鏡應(yīng)用于細(xì)胞和生物分子研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1細(xì)胞學(xué)研究

利用原子力顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞觀察，得到的是貼壁細(xì)胞的真實(shí)形貌。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡僅能得到投影面積，原子力顯微鏡可獲得細(xì)胞表面積和體積數(shù)值，這兩個(gè)數(shù)值更能反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育階段，有利于判斷其活性狀態(tài)。

2007年發(fā)明的誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞(iPS)技術(shù)有效排除了實(shí)驗(yàn)的倫理風(fēng)險(xiǎn)，是非常有潛力的干細(xì)胞技術(shù)。iPS轉(zhuǎn)化過(guò)程中，會(huì)有一定的幾率發(fā)展為癌細(xì)胞。不同體細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞成瘤性有差異。可以使用原子力顯微鏡對(duì)未分化的iPS細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進(jìn)行觀察比較，有效分析細(xì)胞狀態(tài)。HeLa細(xì)胞是一種被廣泛使用的癌變細(xì)胞，因此可以和iPS細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比觀察。

上圖顯示了SPM形狀圖像(a)HeLa細(xì)胞和(b)iPS細(xì)胞。用光學(xué)顯微鏡觀察到的相應(yīng)相位差圖像分別顯示在(c)和(d)中。圖中箭頭所示位置處的截面形狀輪廓如(e)和(f)所示。

從細(xì)胞形態(tài)上來(lái)看，HeLa細(xì)胞呈圓頂形，表面隆起比較高，約7um；而iPS細(xì)胞呈扁平狀且細(xì)胞間粘附呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞高約1.7um。仔細(xì)觀察細(xì)胞之間的邊界，可以看出HeLa細(xì)胞之間的邊界呈凹陷狀，而iPS細(xì)胞之間的邊界是凸起的，而且呈網(wǎng)絡(luò)狀。據(jù)此可分析得知這兩種細(xì)胞各自的間粘附具有差異，且HeLa細(xì)胞之間的粘附較弱，而iPS細(xì)胞之間的粘附較強(qiáng)。

除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以通過(guò)力學(xué)測(cè)量獲得細(xì)胞表面的機(jī)械性能。使用彈簧常數(shù)為0.15N/m的OMCL-TR800PSA探針，在培養(yǎng)液環(huán)境中對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。對(duì)細(xì)胞的最終壓力(排斥力)為2.5nN。通過(guò)比較從探針與樣品接觸的位置到達(dá)到2.5nN的力的變化，確定樣品的硬度。

(a)和(b)顯示了SPM觀察到的HeLa和iPS細(xì)胞的細(xì)胞形狀圖像，(c)和(d)顯示了相應(yīng)的ZX斷面圖像，是從樣品豎截面方向看時(shí)在(a)和(b)中箭頭所示的X線位置處施加到探針的力的圖像。圖中上方為測(cè)量起點(diǎn)，下方白色虛線為壓觸終點(diǎn)，顯示了樣品截面形狀輪廓。

在ZX圖像中，探針與樣品接觸后檢測(cè)到力的位置以黃色到紅色的顏色顯示。因?yàn)檫@表明探針對(duì)細(xì)胞的變形，所以可以理解較大量的細(xì)胞變形顯示細(xì)胞的較軟部分。可以從細(xì)胞變形量了解硬度。(c)中的HeLa細(xì)胞顯示出均勻的變形，但相比之下，在(d)中的iPS細(xì)胞中，細(xì)胞體較軟，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬。

分析結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞表面硬度比較均勻，軟硬部分差別不大，而iPS細(xì)胞主體較軟，細(xì)胞間粘附區(qū)較硬。

2生物大分子的高分辨觀察

生物大分子一般尺度在幾個(gè)納米到幾十個(gè)納米之間，原子力顯微鏡在這個(gè)范圍的納米分辨能力也是非常適合的。例如DNA是經(jīng)常會(huì)被觀測(cè)的一種樣品，使用基于調(diào)幅的輕敲/動(dòng)態(tài)模式，一般只能看清鏈狀結(jié)構(gòu)。

液體環(huán)境下輕敲模式掃描DNA鏈

這種模式受懸臂梁振動(dòng)質(zhì)量因子（Q值）的影響非常大，在液體環(huán)境中，因?yàn)橐后w對(duì)懸臂梁的粘滯阻力，導(dǎo)致Q值急劇降低，從而使分辨率變差。而調(diào)頻模式受此影響較小，可以對(duì)緩沖溶液或者培養(yǎng)液環(huán)境下的生物大分子進(jìn)行超高分辨的觀測(cè)，獲得接觸模式或者輕敲模式無(wú)法達(dá)到的超高分辨率。

同樣是觀察DNA雙螺旋鏈，使用調(diào)頻模式，可以清晰地分辨雙螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋結(jié)構(gòu)形成的大溝小溝結(jié)構(gòu)也非常明顯。

更細(xì)致地觀察一個(gè)螺距，還可以分辨表面的堿基數(shù)目。

對(duì)相鄰兩個(gè)螺旋的剖面圖進(jìn)行分析，觀察到的堿基數(shù)量與理論值完全符合。這說(shuō)明調(diào)頻模式在液體環(huán)境中，對(duì)柔軟的生物樣品觀察，依然可以達(dá)到基團(tuán)級(jí)別的分辨率。

3生物醫(yī)藥應(yīng)用

生命科學(xué)的快速發(fā)展直接推動(dòng)了生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)步，諸多科研成果轉(zhuǎn)化為治療疾病的有效手段。

外泌體和微泡是醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的前沿研究熱點(diǎn)。然而，對(duì)于它們的三維形態(tài)和膜的物理性質(zhì)還有許多方面的認(rèn)識(shí)尚不清楚。外泌體因?yàn)?/span>其單層膜的性質(zhì)，所以非常軟，對(duì)使用原子力顯微鏡測(cè)試提出了極高的要求。

以上兩幅圖就是在生理鹽水環(huán)境中不同尺寸的外泌體，其外徑從20nm到140nm不等，表面極其柔軟，楊氏模量一般只有幾千Pa。

脂質(zhì)體包裹藥物是藥物輸運(yùn)系統(tǒng)（DDS）的一個(gè)重要分支。利用不同的包裹分子，可以實(shí)現(xiàn)藥物的定點(diǎn)投送，有利于提高受體結(jié)合特異性和減少用藥濃度。

利用原子力顯微鏡可以在液體環(huán)境中對(duì)包裹體小球形態(tài)進(jìn)行觀察。

此外，作為精密的力檢測(cè)工具，還可以利用原子力顯微鏡對(duì)包裹體顆粒與液體的固液界面進(jìn)行觀測(cè)，獲得界面處力梯度分布。這項(xiàng)研究有利于分析不同的包裹分子在液體環(huán)境中的自體維持能力和特異位點(diǎn)親和能力，因此是一種很有效的分析工具。

作為可以兼顧高分辨率和液體環(huán)境的微納米分析工具，原子力顯微鏡具備天然的生物學(xué)和生命科學(xué)適用性。隨著其技術(shù)的不斷迭代發(fā)展，已經(jīng)深入地滲透到了生命科學(xué)/醫(yī)學(xué)的研究與實(shí)驗(yàn)中。尤其是如生物醫(yī)學(xué)工程、仿生學(xué)等一些交叉學(xué)科的高速發(fā)展，相信原子力顯微鏡在此領(lǐng)域必有更深入的應(yīng)用。

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